Thessaloniki wurde 315 v. Chr. von dem makedonischen König Kassandros gegründet. Noch zu hellenistischer Zeit wurde Makedonien in vier Teile geteilt (nach dem zweiten Makedonisch-Römischen Krieg). Von 168 v. Chr. bis 148 v. Chr. war Thessaloniki Hauptstadt eines dieser vier Teile, wurde aber mit der endgültigen Eingliederung in das Römische Reich zur Hauptstadt der Provinz Macedonia. Die Zeit der Eigenständigkeit für das Königreich war vorüber.
Thessaloniki lag an der Via Egnatia, dem Hauptverkehrsweg zwischen Rom und Byzanz, und an der nach Norden führenden Balkanstraße. 58 v. Chr. ging Cicero vorübergehend hierher in die Verbannung. Nach der Flucht aus Italien vor Caesar 49 v. Chr. verlegten die Konsuln ihr Quartier nach Thessaloniki. Etwa 200 Senatoren folgten ihrer Einladung. Sie erklärten den Versammlungsplatz zu römischem Staatsboden, so dass Senatssitzungen abgehalten werden konnten. Dieses Privileg währte nur ein Jahr. Caesar besiegte In der Schlacht von Pharsalos auch seine letzten Feinde und wird Diktator des Römischen Reichs.
Im weiteren Verlauf des Römischen Bürgerkrieges wechselt Thessaloniki notgedrungen die Seiten. Brutus, Stiefsohn und einer der Mörder Caesars, versprach seiner Truppe für den Fall des Sieges die Plünderung von Thessaloniki. Aus der Schlacht in Philippi ging jedoch das Heer des Octavian als Sieger hervor. Als Dank für die Unterstützung gegen Brutus wurde Thessaloniki „Civitas Libera“ - eine Freie Stadt.
Etwa 49 oder 50 n. Chr. hielt sich der Apostel Paulus auf seiner zweiten Missionsreise in Thessaloniki auf und gründete die zweite namentlich genannte Christengemeinde Europas nach Philippi. Die Christianisierung war der Beginn des Wiederstandes der Bevölkerung von Thessaloniki gegen die Römische Herrschaft – es entstanden mehrere frühchristliche Kirchen. Eine der ersten war die Kirche Johannes des Täufers.
Unter dem Kaiser Gaius Galerius Valerius Maximianus (250-311 n.Chr.) erlangte Thessalonika große Bedeutung. Nach dem Rücktritt Diokletians als Kaiser ünernahm Galerius dessen Kaiserkrone. Um das Jahr 306 n. Chr. bestimmte er die Stadt zu seinem Regierungssitz. Der östliche Teil des Römischen Reiches wurde fortan von dort geleitet.
